神经病理性疼痛是一种慢性病理性疼痛状态，在损伤去除后可持续存在，国际疼痛学会将神经病理性疼痛定义为由躯体感觉神经系统的损伤或疾病直接造成的疼痛，其临床表现多种多样，包括自发性疼痛(如烧灼痛、麻刺痛、跳样痛、电击样痛等)、痛觉过敏及痛觉超敏等。这种慢性持续性的疼痛症状不仅对患者的健康和生活质量产生很不利的影响，还因医疗上的花费而加重家庭和社会负担。研究证实，神经病理性疼痛的病理生理学机制主要包括外周敏化、中枢敏化和神经胶质细胞的活化，中枢敏化主要发生在脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)，感觉神经元Ｎ-甲基-Ｄ-天冬氨酸受体(NMDA-R)的上调、中间抑制性神经元γ-氨基丁酸受体(GABA-R)的表达下降，均在疼痛的起始和形成过程中发挥重要的调控作用。目前常用的治疗手段主要包括药物治疗、物理治疗、神经调控治疗、微创治疗、心理治疗等，但仍以药物治疗为主。然而，仅有40%的患者通过药物治疗获得了良好的效果，更重要的是，即使对减轻患者的疼痛有益处，许多药物的不良反应仍会导致治疗的终止。因此，找到一种经济有效且可被广泛应用的治疗方法是很有价值的。

          经颅直流电刺激(tDCS)作为非侵入性经颅大脑刺激的一种，具有镇痛效果显著、作用持久、不良反应小、简便经济等优点，重复的刺激能获得更好的镇痛及持续效应。目前临床多应用1.0~2.0mA的阳极电流兴奋大脑初级运动皮质(M1)，连续刺激5~10d，每日治疗20min。研究证实，tDCS通过调节神经元网络的各种活动而发挥镇痛作用，并在刺激时及刺激结束后的一段时间均可影响皮质兴奋性，这可能与改变神经元静息膜电位变化、参与突触可塑性调节及增加皮质内抑制相关。此外，tDCS还对和刺激部位相关联的远端大脑区域产生影响。

        目前，tDCS的镇痛效应在脊髓水平的研究还很少，相关神经生理学机制仍不清楚。本研究采用经典坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型致大鼠发生创伤后疼痛性周围神经病变，给予大鼠连续8d的tDCS刺激，观察其镇痛效果，并通过研究脊髓背角NMDA-R和GABA-R的表达，以初步探讨tDCS发挥镇痛作用的理论基础。

         成年雄性(SD)大鼠40只，体重180~220g，自华中科技大学同济医学院实验动物中心处购买。将大鼠置于安静、整洁的环境饲养3d以上，明暗各12h，自由摄食、饮水。按随机数字表法选取10只大鼠纳入正常组(n＝10)，10只大鼠纳入假手术组(n＝10)，其余20只大鼠行CCI的模型制作，并按照随机数字表法分为假治疗组(ｎ＝10)和治疗组(n＝10)。

        大鼠CCI模型制备参照美国国立卫生研究院Bennett等1988年研发的造模方法，通过结扎坐骨神经主干，对表浅的神经外膜血液循环起到阻碍作用，神经水肿、膨胀并在结扎部位产生自缢，这种慢性压迫性损伤导致坐骨神经发生疼痛性周围神经病变。

        CCI模型制作：大鼠称重，按3mL/kg剂量经大鼠腹腔注射10％的水合氯醛，剃除左侧大腿后外侧毛发，俯卧位固定于37℃热毯上，将左大腿放置在与脊柱成90°的位置，用胶带固定左后足；消毒手术区域，平行于左股骨下3~4mm处作一水平切口，长约1.5cm，钝性分离股二头肌和臀肌浅层肌肉，用拉钩拉开两肌肉之间的间隙，充分暴露其下的坐骨神经及其分支；使用弯曲的钝头钳和微型剪刀，轻轻地分离坐骨神经，从它起始于坐骨结节的近心端至远端腘窝的分叉处，约10mm；自坐骨神经主干近分叉处起，用4-0的普通丝线依次结扎4个双结，间隔1mm，当观察到手术测暴露的肌肉出现微微颤动时立即停止结扎。假手术组仅分离坐骨神经，不结扎。充分止血后，用3-0丝线逐层缝合肌肉及皮肤切口。术毕，将大鼠置于电热毯上待其苏醒，醒后在安静、清洁的环境里饲养。

        CCI造模后大鼠5~7d开始出现痛反应，10~14d达高峰并稳定持续2个月。因此，本研究选择术后第14天作为tDCS干预的时间点。

        1.治疗组大鼠自术后第14天起，给予连续8d的tDCS治疗，具体步骤：将大鼠固定于柔软型大鼠固定器上，剔除大鼠头颈部毛发，连接tDCS设备及HD-tDCS适配器，参考Spezia Adachi等的研究，设定tDCS设备的刺激参数为刺激电流强度0.5mA、持续时间20min，将连接于HD-tDCS适配器的2个环形电极片置于大鼠头颈部，即阳极置于大鼠颈部两耳之间、阴极置于大鼠双眼外侧角中点；电极片下放置适宜大小的浸泡过生理盐水的棉球，用胶布固定电极片。

       2.假治疗组大鼠自术后第14天起，给予tDCS假治疗，持续8d，将tDCS设备调整至假刺激模式(即每次电流仅持续30s)，余参数及步骤同治疗组。

       3.正常组和假手术组均不给予任何干预。

（一）行为学观察

在对大鼠进行痛阈测定之前，将大鼠放在地板上观察1~2min，注意其站立、行走及休息的姿势，以及其左后爪、足趾的形态学变化。

（二）疼痛反应的测试

坐骨神经末端分支支配的足底区域在CCI术后出现明显的疼痛反应，为主要的测试部位，即足垫后的中央足底表面，并且避开脚后跟和脚垫等部位。分别于术前1d、术后14d及术后22d(即tDCS干预8d后)进行测试。

1.von Frey试验:用up-and-down法，通过机械刺激诱发大鼠发生疼痛反应(缩足反射或舔足反应)，记录大鼠缩足反应的阈值，即50%缩爪阈值(50%MWT)，简称机械痛。

具体方法:将大鼠依次放入钢丝网格上的透明分隔笼中，使大鼠适应其周围环境(约15min)，即大鼠在笼内的走动、洗脸、探索等行为结束后再对其进行测试；von Frey丝的刺激力度依次为0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和15.0g。首先，用2.0g的von Frey丝垂直刺向大鼠左后足掌部，并且使细丝发生一定程度的弯曲并维持8s。如果刺激时大鼠的左后足在测试时间内或移开细丝的瞬间发生缩足反射或舔足反应，则记为阳性反应，以“X”表示，并降低一级刺激强度(即用1.4g)进行下一次测定；相反，如果没有引发大鼠上述反应，则记为阴性反应，即“O”，并用更高一级的刺激强度(即用4g)再次测试，以此类推。注意2次刺激之间应至少间隔10s，即动物恢复安静状态后再进行下一次刺激。当出现与前次不同的反应(即从“O”到“X”，或“X”到“O”)时开始记录，再按上述方法依次刺激4次，共刺激6次，按照记录的反应进行计算。如果刺激减至0.4g大鼠反应一直记录为“X”或加至15.0g均为“O”，则直接记录50%MWT为0.25g或15.0g。

计算公式为：50%MWT＝10log(ｘ)＋ｋδ，式中Ｘ为最后刺激使用的力度，ｋ为不同刺激方式的系数，δ指各刺激力度log值的方差。

2.动物热板试验：使用热痛刺激仪，通过热刺激诱发大鼠发生疼痛反应(缩足反射或舔足反应)，记录大鼠缩足反应潜伏期(WTL)，简称热痛。

具体方法：测定前，调整红外热强度值(本研究为90)，使正常组大鼠的WTL平均值为10s左右。设置热刺激的最长持续时间为20s，以避免对左后足的组织损伤；然后将大鼠分别置于玻璃板上的透明分隔笼中，适应环境约15min后进行测试。将热痛刺激仪的红外热源放在大鼠左后足掌部正下方，按下启动键。仪器自动记录从热刺激开始到左后足发生缩足反应的持续时间，重复上述测量3次，每次间隔5min，计算其平均值，记作大鼠的WTL值。

        大鼠麻醉后，尽量去除脊柱两旁肌肉，暴露其骨性结构，在脊柱胸8水平将上段剪断，再沿骶1水平将脊柱下段剪断。用咬骨钳咬掉脊柱的椎骨，暴露出脊髓，用刀片快速取腰膨大组织并划断其周围的神经，用4上℃述的步生骤理尽盐可水能反在复冰冲上洗进，去除组织周围的血液成分，上述步骤尽可能在冰上进行。

         将蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂分别按照1：100的比例加入RIPA裂解液中;按照每100mg组织加入1000ul裂解液的比例将腰膨大组织和裂解液加入到清洁消毒的玻璃匀浆器中，在冰上充分匀浆、裂解30min。吸取组织匀浆液至清洁的离心管中，在4℃下12000r/min离心5min(离心半径5cm)，取蛋白上清待测，用BCA试剂盒测量其蛋白浓度。将待检测蛋白与5x蛋白上样缓冲液混合，沸水中煮10min变性。取50ug总蛋白上样，行SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩80Ｖ30min，分离120Ｖ90min)。取出凝胶后根据Marker切下目的条带，剪与凝胶大小相同的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜放入甲醇中浸泡，在电转缓冲液中，按照黑色板－纤维垫－滤纸－凝胶－PVDF膜－滤纸－纤维垫－白色板的顺序依次放好，开始转膜(NR2B-NMdA-RGABAa-R:200mA120min；GABAb-R:200mA120min后300mA25min)；以5％BSA封闭液浸泡PVDF膜，于室温下摇床封闭2h；用封闭液稀释一抗(NR2B-NMdA-R：1：800，GABAa-R和GABAb-R：１：500)，将PVDF膜浸泡于稀释后的一抗工作液中，4℃孵育过夜ꎮ封闭液洗脱PVDF膜5~6次，5min/次。将PVDF膜浸泡于封闭液稀释后HRP标记的二抗(1∶5000稀释)，37℃摇床孵育2h。TBST洗脱PVDF膜5~6次，5min/次。采用ECL化学发光检测实验结果。晾干、扫描胶片，分析胶片灰度值。分析和比较各组大鼠的NR2B-NMdA-R、GABAa-R、GABAb-R蛋白与GAPdH的比值即相对表达量。

        使用SPSS 26.0版统计软件对所得数据进行统计学分析处理，数据均呈正态分布，以(ｘ－±ｓ)表示。多组间的比较采用单因素方差分析，组内对比采用配对样本t检验，术后22d组间进行两两比较采用独立样本t检验，Ｐ<0.05认为差异有统计学意义。

        假治疗组及治疗组大鼠术后出现左后足畸形，表现为足趾内聚、腹屈，左足外翻；行走时出现明显跛行、垂足步态，站立时抬起患足、将其屈曲，放于大腿旁成保护性姿势；此外还可自发性舔左后足，无任何自残现象。假手术组大鼠术后无左足畸形、无跛行，各足趾可正常展开负重。

        1.各组大鼠50%MWT值的变化：术前1d，4组大鼠的50%MWT值组间差异无统计学意义(Ｐ>0.05)。术后第14天，与术前1d比较，假治疗组和治疗组的50%MWT值显著下降(Ｐ<0.001)，但正常组和假手术组组内比较差异无统计学意义(Ｐ>0.05)；术后第14天组间比较，假手术组与正常组同时间点比较，差异无统计学意义(Ｐ>0.05)；假治疗组和治疗组的50%MWT值均显著下降，分别与假手术组同时间点比较，组间差异有统计学意义(Ｐ<0.001)，而假治疗组与治疗组同时间点比较，差异无统计学意义(Ｐ>0.05)。术后第22天与术后第14天比较，假治疗组差异无统计学意义(Ｐ>0.05)，治疗组50%MWT值明显上升(Ｐ<0.001)；治疗组术后第22天的50%MWT值亦较假治疗组同时间点升高(Ｐ<0.05)，详见表１。

         2.各组大鼠WTL值的变化：术前1d，4组大鼠的WTL值组间差异均无统计学意义(Ｐ>0.05)。术后第14天，与术前1d比较，假治疗组和治疗组WTL值明显下降(Ｐ<0.001)，但正常组和假手术组的WTL值组内比较差异无统计学意义(Ｐ>0.05)；术后第14天，假手术组与正常组同时间点比较，差异无统计学意义(Ｐ>0.05)；假治疗组和治疗组的WTL值均下降，分别与假手术组同时间点比较，组间差异有统计学意义(Ｐ<0.001)，假治疗组与治疗组同时间点比较，差异无统计学意义(Ｐ>0.05)。术后第22天，治疗组的WTL值显著上升(Ｐ<0.001)，且明显高于假治疗组(Ｐ<0.001)，与术后第14天比较，治疗组组内差异有统计学意义(Ｐ<0.001)，假治疗组的组内差异无统计学意义(Ｐ>0.05)，而治疗组术后第22天的WTL值与术前1d比较，组内差异无统计学意义(Ｐ>0.05)，详见表２。

       术后22d，假手术组的NR2B-NMdA-R、GABAa-R、GABAb-R的蛋白相对表达量与正常组对比，组间差异均无统计学意义(Ｐ>0.05)。假治疗组的NR2B-NMdA-R蛋白相对表达量较假手术组明显上升(Ｐ<0.001)，治疗组则较假治疗组明显下降(Ｐ<0.001)，而治疗组与假手术组对比，组间差异无统计学意义(Ｐ>0.05)；假治疗组GABAa-R和GABAb-R蛋白的相对表达量均较假手术组明显下降(Ｐ<0.001)，而治疗组治疗后的GABAa-R蛋白相对表达量明显高于假治疗组(Ｐ<0.001)，但其GABAb-R的蛋白相对表达量与假治疗组比较，差异无统计学意义(Ｐ>0.05)，详见表３和图１。

        本研究结果显示，CCI术后第14天大鼠出现明显的疼痛反应，即50%MWT值和WTL值均显著下降，连续8d的tDCS刺激可使50%MWT值和WTL值升高，提示重复的tDCS对机械痛和热痛均有改善作用；术后第22天，治疗组的WTL值可升高至术前1d的水平，提示重复的tDCS可使热痛恢复至正常水平；然而，术后第22天，治疗组的50%MWT值虽然也出现上升，但幅度较小，与术前1d有差距，提示重复的tDCS虽然也可改善机械痛，但作用有限。神经病理性疼痛的临床表现中，机体对热刺激等伤害性刺激的敏感性增加即为痛觉过敏，当机械刺激等非伤害性刺激也可诱发疼痛反应时，则表现为痛觉超敏。动物研究中常用热辐射产生的疼痛(如热痛)来反映痛觉过敏，用纤维丝刺激产生的疼痛(如机械痛)来反映痛觉超敏。本实验结果提示，重复的tDCS刺激对改善神经病理性疼痛的痛觉过敏现象优于痛觉超敏。

         神经病理性疼痛的体感传导通路涉及外周到中枢的多个区域，如外周伤害性感受器、感觉神经纤维、感觉背根神经节细胞、脊髓背角、丘脑及大脑皮质等。临床上选择大脑皮质的M1区作为tDCS的阳极刺激部位，通过M1区下行的投射纤维间接影响疼痛相关区域的神经网络来调控痛知觉，如丘脑核团，后者可影响其他疼痛相关区域的活动，如扣带回前部、背外侧前额叶皮质、岛叶及脊髓，最终调节疼痛及其情感、认知部分，也抑制疼痛从脊髓的传入，这种自上而下的调控机制可以解释tDCS作用于Ｍ1区的镇痛效应。刺激参数在tDCS的应用过程中也发挥重要作用，如电极片的位置及面积、电流的强度、刺激频率及持续时间等，刺激参数组合方式的不同诱发tDCS发挥不同的治疗作用。本研究治疗参数的选择，参考了Adachi等的研究，模拟临床治疗方案，给予大鼠0.5mA，20min/d，连续8d的tDCS刺激，阳极位于大鼠顶叶皮质，阴极位于框上区，使M1区位于两电极之间，从而使M1区效应最大化。

        神经病理性疼痛发生时，脊髓背角发生至关重要的中枢敏化现象，即神经元持续的过度兴奋状态，其中，NMdA-R上调并介导突触传递发生可塑性变化，而GABA能中间抑制性神经元占背角神经元的大多数,其抑制作用的减弱或去抑制，也可导致神经元网络兴奋性的增高,并激活在通常情况下由于抑制作用而沉默的感觉传导通路，故本研究在脊髓水平选择了NMdA-R和GABA-R作为检测指标。NMdA离子通道型受体是由3种亚基组成的四聚体2NR1、NR2A或NR2B，其中NR2B主要分布于脊髓背角浅层说、背角神经节传导痛觉的Aδ类及C类纤维，也就是说，NR2B-NMdA-R对脊髓伤害性感觉信号传递至关重要。研究证实，神经病理性疼痛时，脊髓背角神经元NR2B的表达增加，而抑制NR2B可以产生镇痛效应。本研究重点对脊髓NR2B-NMdA-R进行检测，并初步观察到，CCI术后神经病理性疼痛大鼠的脊髓NR2B-NMdA-R表达是增高的，而重复的tDCS刺激后，受体在脊髓中的表达发生明显下调，而这种调节作用可使增高的受体恢复至正常水平状态。GABA受体主要包含离子通道型GABAa-R和代谢型GABAb-R两种类型，两者集中分布在背角浅层。本研究通过检测脊髓GABAa-R和GABAb-R的表达，初步观察到神经病理性疼痛时，大鼠脊髓中GABAa-R和GABAb-R的表达均减少，重复tDCS刺激后仅观察到GABAa-R在脊髓中的表达发生一定程度的上调，但未恢复至正常水平，然而本研究并未观察到tDCS对脊髓GABAb-R具有明显的调节作用。

       重复经颅直流电刺激可改善神经病理性疼痛反应，并对痛觉过敏(热痛)的改善优于痛觉超敏(机械痛)，其作用机制可能是下调脊髓NR2B-NMDA-R至正常水平，并部分上调GABAa-R。

参考文献

李冰冰,许涛,王胜洁,等.重复经颅直流电刺激治疗神经病理性疼痛的效果观察及机制初探[J].中华物理医学与康复杂志,2022,44(4):312-317